当時の室町幕府の中央政権の中心だった管領の細川晴元が敵対勢力と対立抗争が絶えず、義昭の父義晴はその影響で京都を逃れて近江に避難したり、また京都へ戻ったりという生活で、義昭も避難中に生まれたよう。

天文11年(1542年)11月に5歳の義昭は、跡目争い防止、そして寺社との結びつきを強めるため跡継ぎ以外の息子を出家させるという足利将軍家の慣習で、外祖父近衛尚通の猶子として奈良の興福寺の一乗院門跡として入室、法名を覚慶(かくけい)に。義昭はのちに興福寺で権少僧都にまで栄進、このまま僧として一生を終えるはずだったのですね。

矢島御所での義昭は、三管領家の一つの河内国の畠山高政、関東管領の上杉輝虎、能登国守護の畠山義綱（近江滋賀郡に在国）らと親密に連絡をとって上洛の機会を窺うことに。義昭らの構想としては、敵対関係にあった六角氏、浅井氏、斎藤氏、織田氏、武田氏、上杉氏、後北条氏らを和解させて協力一致して上洛を目指すものであったよう。そして和田惟政と細川藤孝の説得で、信長と斎藤龍興は和解したために、信長が美濃から六角氏の勢力圏の北伊勢、南近江経由で上洛することに。この義昭の行動で、三好三人衆のひとりの三好長逸(ながやす)の軍勢が矢島御所を襲撃したが、大草氏などの奉公衆の奮戦で撃退。

しかし、永禄9年(1566年)8月、先の約束通り上洛の兵を起こした信長の軍は斎藤龍興の襲撃で尾張国に撤退、さらに六角義賢、義治父子が三好三人衆と密かに内通したという情報で、義昭は妹婿の武田義統を頼って若狭国へ移ったが、義統は息子との家督抗争や重臣の謀反などで国内が安定していなかったので、上洛できず。

義昭は、永禄9年(1566年)9月、若狭から越前国の朝倉義景のもとへ移って上洛への助力を要請。朝倉義景は細川藤孝らによる義昭の奈良脱出の黒幕説もあるが、客将として足利将軍家連枝の「鞍谷御所」と呼ばれた足利嗣知（足利義嗣の子孫）がいたために、義昭を奉じての積極的な上洛をする意思を表さないので長期滞在に。

義昭は、朝倉氏よりも上杉輝虎(謙信)を頼りにしていたが、武田信玄との対立で上洛は不可能だったということ。

一方、三好三人衆が擁する義昭の父の弟の息子である義栄は、義昭に半年遅れて永禄9年(1566年)12月に従五位下左馬頭への任官許可が出されて、永禄10年（1567年）1月に正式に叙任。11月に、朝廷に対して将軍宣下を申請したが、朝廷の要求した献金に応じられず拒絶され、その後の交渉で永禄11年(1568年)2月に朝廷から将軍宣下があり、義栄は摂津の国に滞在したままで第14代将軍に就任。

将軍に就任した義昭は、兄の義輝暗殺、また足利義栄の将軍就任に便宜をはかったとして近衛前久を追放、二条晴良を関白職に復職させました。

また、幕府の管領家の細川昭元、畠山昭高、朝廷の関白家である二条昭実に偏諱を与え、領地を安堵したりと政権安定につとめて、兄義輝の山城国の御料所(室町幕府の直轄領)も掌握、山城国には守護を置かず、三淵藤英を伏見に配置したなど、今まで義昭と行動を供にしていた奉行衆も職務に復帰して幕府の機能が再興。

義昭は、本圀寺(現京都市山科区)を仮御所としていましたが、永禄12年(1569年)1月､信長の兵が明智光秀らに義昭の警護を任せて領国の美濃、尾張に帰還した後、三好三人衆が巻き返し、信長に敗れて流浪中だった美濃の斎藤龍興も加わって本圀寺が襲撃、しかし奉公衆および北近江の浅井長政、摂津国の和田惟政らの奮戦で撃退したということ。

信長は岐阜で本國寺が襲撃の報告を受け、大雪のなか本来3日の行程を2日で走破して10騎足らずの供を連れて本國寺に到着。このとき信長配下には凍死者が出たほどの急行軍だったが、信長は、池田衆らに功賞を与え、御所の防衛を堅固にするために将軍御所の造営を開始することに。

義昭は信長に命じて兄義輝が本拠を置いていた烏丸中御門第（旧二条城）を整備。この烏丸中御門第は、二重の水堀で囲われ高い石垣を新たに構築された、防御機能が充実した洛中の平城ともいえる、大規模な城郭風だったということです。

義昭は信長の武功に報いるために、3歳年上の信長に「室町殿御父」の称号を与え、信長が上洛の恩賞として尾張、美濃領有の公認、旧三好領の堺、和泉一国の支配を望んだので、和泉国守護に任命。義昭はさらに信長に対して、管領代または管領の地位、朝廷へ副将軍への推挙を申し入れたが、信長は、弾正忠への正式な叙任の推挙のみを受け、その他の武将にも論功行賞が行われたということ。

しかし将軍となった義昭と、武力による天下統一を狙う信長の関係は徐々に悪化。永禄12年（1569年）8月に信長は伊勢国の北畠氏を攻めたが、北畠氏の抵抗でなかなか城を陥落できず、信長は義昭に仲介を要請、10月に和睦が成立したが、その後、信長が次男信雄を北畠氏の養子に押し付けたなど、義昭の意向に反する措置を取ったため、一層関係悪化につながったそう。

信長は義昭の将軍権力を制約しようとして、永禄12年(1569年)1月､殿中御掟という9箇条の掟書を義昭に承認させ、永禄13年(1570年)1月には5箇条が追加されたということ。

この殿中御掟は、最近になって、信長は単純に将軍権力を制約したかったのではなく、ほとんどの条文が室町幕府の規範や先例からの出典のため、信長が幕府法や先例を吟味した上で幕府再興の理念を示したとする説も。しかし義昭がこの殿中御掟を遵守しなかったために、信長と義昭の関係は対立に向かったということ。

元亀元年(1570年)4月､信長は徳川家康とともに姉川の戦いで浅井、朝倉連合軍に勝利。 信長は義昭と共に三好三人衆らを討伐に向かう途中で石山本願寺、浅井氏、朝倉氏が挙兵したために近江へ引き返したが、浅井、朝倉氏は比叡山延暦寺に立てこもり、さらに伊勢では一向一揆が蜂起となったため、12月には信長は、義昭に和睦の調停を依頼し、義昭は、関白二条晴良に調停の実務を要請したということです。

義昭は信長に不満を持ち、元亀2年（1571年）頃から上杉輝虎（謙信）、毛利輝元、本願寺顕如、甲斐国の武田信玄、六角義賢らに御内書を下したのですが、これが信長包囲網と呼ばれるように。この包囲網には他にも信長と対立していた朝倉義景、浅井長政、延暦寺、義昭の兄義輝の敵だった松永久秀、三好三人衆、三好義継らも加わっていたが、まだこのときは義昭と信長は全面的に対立したわけではなかったそう。

元亀3年（1572年）10月、信長は義昭に、義昭を批判した17条の意見書を送付、また世間一般にもこの意見書を流布させたために、信長と義昭の敵対関係が明確になり、義昭は挙兵。そして武田信玄が西上作戦を開始し、12月には三方ヶ原の戦いで信長の同盟者の徳川家康の軍勢を撃破するなどで信長は窮地に陥ったが、その後、朝倉義景が越前に撤退。

元亀4年（1573年）正月、信長は子を人質として義昭に和睦を申し入れたが、義昭は一蹴。そして近江の今堅田城と石山城に幕府の軍勢を入れて反信長の旗を揚げたが、攻撃を受けると数日で陥落。その頃信玄の病状が悪化したために武田軍は4月に甲斐の国へ撤退し、信玄は死去。

信長は上洛して知恩院に陣取りましたが、義昭に付き従っていた幕臣の細川藤孝や荒木村重らは義昭を見限って、信長側に付いたということ。しかし信玄の死が伝わっていなかったらしい義昭は烏丸中御門第にこもり、さらに抵抗。信長は再度和睦を要請したが、義昭は拒否、信長は幕臣や義昭の支持者の屋敷のある上京全域を焼き討ちにして烏丸中御門第を包囲して義昭に圧力をかけたり朝廷に工作した結果、4月に勅命による講和が成立しました。

しかし7月、義昭は講和を破棄、烏丸中御門第を三淵藤英らに預けて自分は南山城の槇島城に移って再挙兵しました。が、烏丸中御門第の三淵藤英も10日に降伏、槇島城も7万の織田軍に包囲され、攻撃でほとんど破壊されたために降伏。

信長は義昭の京都追放を実行し、足利将軍家の御料所を自領として天正への改元を行いました。そして8月には朝倉氏、9月に浅井氏を滅ぼして信長包囲網は瓦解。

信長は、これまで室町幕府が行ってきた業務を京都所司代として家臣の村井貞勝に行わせ、天正2年（1574年）には家臣の塙直政を山城、大和の守護に任じて畿内を支配し、それまでの義昭を擁した間接的なものと違い、天下人としての地位を確立したのですね。

義昭は、打倒信長を目指していたので、本能寺の変の黒幕だったのではと疑われることがあります。

が、6月9日に明智光秀が細川藤孝、忠興父子に宛てた覚書には、光秀と藤孝にとって旧主の義昭の存在が全く見えないので、義昭が光秀の謀反に関わっていたとすれば不自然だということ。

また義昭のもとに、信長を自害させたという密書が届けられた形跡がなく光秀とのつながりを示す材料もなし、そして義昭を支援していた毛利家が備中高松城水攻めの講和の後、中国大返しの秀吉を追走しなかった行動も筋が通らないということで、義昭黒幕説は否定されているそう。

天正15年（1587年）、秀吉は九州平定に向かう途中に、義昭の住む備後国沼隈郡津之郷の御所付近を訪れて義昭と対面し、太刀の交換をしたそう。そして秀吉の九州平定後の10月に義昭は京都に帰還。天正16年（1588年）1月13日に秀吉に従って参内し、将軍職を辞したのちに出家して、昌山（道休）と号し、朝廷から准三后の称号を受けて秀吉に1万石をもらい、格式は大大名級で御伽衆として伺候することに。

尚、秀吉が征夷大将軍になりたいために義昭の養子になろうとしたが断られたという話がありますが、これは江戸時代に徳川家のお抱え儒学者だった林羅山が広めたもので、家康と徳川家アゲのための作り話だということ。

義昭は、文禄、慶長の役には、秀吉の要請により由緒ある奉公衆などの名家の軍勢200人を従えて肥前国名護屋まで参陣したが、慶長2年(1597年)8月、大坂にて61歳で死去。